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沙門氏菌選擇性培養基中疑似菌落探討

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沙門氏菌選擇性培養基中生長的疑似菌落一定是沙門氏菌么?不一定哦。本文中所探討的弗氏檸檬酸菌桿菌(Citrobacter freundii)就是一種常見的干擾菌,由于其與沙門氏菌在生理生化上具有很多相似的特性,如氧化酶、脂肪酶、苯丙氨酸脫氫酶測試都呈陰性,多數菌株能利用檸檬酸鹽,可以利用硫代硫酸鹽產生H2S(造成沙門氏菌選擇性培養基假陽性的主要原因)等,可能使得檢測人員對檢測結果產生誤判,因此《藥典》也強調仍需對疑似菌落進行適宜的鑒定。本文對檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)和沙門屬菌屬(Salmonella)的生理生化特性上的異同進行了比較,同時也從基因組水平上分析這兩類菌產生相似理化現象的遺傳基礎,有耐心的看官就請繼續往下看吧。

研究背景

沙門氏菌屬(Salmonella)是腸桿菌科中一種重要的人畜致病菌,部分菌株可引起胃腸炎、傷寒、副傷寒、敗血癥等疾病。2015版《中國藥典》明確將其作為控制菌進行檢查。

藥典對沙門氏菌的檢測主要分為三步:①供試液制備和增菌培養;②選擇和分離培養;③結果判定。主要利用胰酪大豆胨液體培養基的增菌,木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基和三糖鐵瓊脂培養基的篩菌及顯色反應來檢測沙門氏菌。但往往在沙門氏菌選擇性培養基中會出現雜菌干擾。因此,藥典也強調,在最后三糖鐵瓊脂培養基上出現沙門氏菌的疑似菌落時,仍需進一步做適宜的鑒定試驗。

沙門氏菌選擇性培養中出現干擾菌的主要原因為干擾菌有許多生理生化特性和沙門氏菌相似,可利用葡萄糖并且產生酸,還可通過代謝培養基中的硫代硫酸鹽產生硫化氫,能與培養基中鐵鹽反應生成黑色硫化鐵。近期,實驗發現有株菌能夠在沙門氏選擇性培養基中出現疑似沙門氏菌的理化特性,但是通過進一步鑒定發現是一株弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)。查閱第二版《伯杰氏系統細菌學手冊》發現檸檬酸桿菌屬和沙門氏菌屬有許多相似之處,這也說明了為何檸檬酸桿菌屬會成為一種常見沙門氏選擇性培養基的干擾菌。

本文將從基因組水平上分析兩類菌為何會出現相似的理化反應,探討調控H2S產生基因(PHS基因)的結構,揭示了部分檸檬酸桿菌屬為何會在沙門氏菌選擇性培養基出現和沙門氏菌相似理化現象的遺傳基礎,這對了解和鑒定兩類菌具有重要指導意義。

沙門氏菌屬(Salmonella

沙門氏菌屬(Salmonella)是腸桿菌科中一個重要成員,在1885年,由美國獸醫師丹尼爾?E?沙門首次分離得到,主要寄生于人和動物腸道內,是一類重要致病菌。大多數沙門氏菌對人和動物都有致病性,是目前引起人類食物中毒的一種重要致病菌,在食品、藥品、公共衛生領域都給予了極大重視。根據第二部《伯杰氏系統細菌學手冊》介紹,沙門氏菌屬(Salmonella),革蘭氏陰性桿菌,周生鞭毛運動,兼性厭氧,可利用D -葡萄糖產生氣體。多數沙門氏菌都能產生硫化氫,但也有少數血清型的不能產生硫化氫,吲哚實驗一般呈陰性,可將檸檬酸鹽作為唯一碳源,通常賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶的反應呈陽性,脲酶陰性,一般不能發酵蔗糖、水楊酸、肌醇和杏仁苷,不產生脂肪酶和脫氧核糖核酸酶,具有致病性,可引起胃腸炎、傷寒、副傷寒、敗血癥等疾病。

常見沙門氏菌種有腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)和邦戈爾沙門氏菌(Salmonella bongori),其中腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)又分為6個亞種,分別是腸沙門氏菌腸亞種(Salmonella enteritidissubsp.enterica)、腸沙門氏菌薩拉姆亞種(Salmonella enteritidis subsp. salamae)、腸沙門氏菌亞利桑那亞種(Salmonella enteritidis subsp. arizonae)、腸沙門氏菌印度亞種(Salmonella enteritidis subsp. indica)、腸沙門氏菌豪頓亞種(Salmonella enteritidis subsp. houtenae)和腸沙門氏菌雙亞利桑那亞種(Salmonella enteritidis subsp. diarizonae)。由于沙門氏菌分型繁多,到目前為止已確定的沙門氏菌的血清型就超過2500[4]。沙門氏菌的致病性和菌產生毒力因子密切相關,其主要的毒力因子有毒力質粒、脂多糖、菌毛等。

據統計全球每年有超過1億人感染沙門氏菌,因此而死亡人數超過15萬。尤其在畜牧食品領域發生過許多重大事件。據統計,我國的細菌性食物中毒事件中有70~80%都是由沙門氏菌引起。雖然在藥品領域出現沙門氏菌污染事件并不多,但依然值得我們加以重視。

檸檬酸桿菌屬(Citrobacter

檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)也叫枸櫞酸桿菌屬,革蘭氏陽性桿菌,屬于腸桿菌科,周鞭毛運動,兼性厭氧,是一種常見的腸道細菌,菌落光滑、低凸、濕潤、半透明或不透明,呈灰色,表面光滑,邊緣整齊,氧化酶陰性,過氧化氫酶陽性,化能有機異樣,多數菌株可利用檸檬酸作為唯一碳源,無賴氨酸脫羧酶,不能分解海藻酸和果膠酸鹽,可利用D-葡萄糖發酵產生酸和氣體,甲基紅測試陽性,VP實驗陽性,常見于人和動物的糞便,也可在土壤、水和食物出現。

檸檬桿菌屬(Citrobacter)最早被人們稱為弗勞地埃希菌 “Escherichia freundii”,是被包含在埃希氏菌屬中,1958年開始被列為獨立的菌屬,最早只有弗勞地氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)1個種,直到1986年才多出了2個新種。目前伯杰氏系統細菌學手冊中收入11個種,包括:弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii),科氏檸檬酸桿菌(Citrobacter koseri),無丙二酸鹽檸檬酸桿菌(Citrobacter amalonaticus),法氏檸檬酸桿菌(Citrobacter farmeri),楊氏檸檬酸桿菌(Citrobacter younge),布氏檸檬酸桿菌(Citrobacter braakii),魏氏檸檬酸桿菌(Citrobacter werkmanii),塞氏檸檬酸桿菌(Citrobacter sedlakii),嚙齒檸檬酸桿菌(Citrobacter rodentium),吉氏檸檬酸桿菌(Citrobacter gillienii),默氏檸檬酸桿菌(Citrobacter murrlinae)。在2015年和2017年,又發現了Citrobacter pasteurii Citrobacter europaeus 兩個新種。檸檬酸桿菌屬種大多數的菌種都能夠在克氏雙糖鐵培養基和三糖鐵培養基中上產生H2S

近年來研究表明,檸檬酸桿菌屬部分菌株也具有致病性,可能引起腹瀉、敗血癥、腦膜炎、呼吸道和泌尿道感染等疾病,其主要致病菌種是部分出現在臨床的弗氏檸檬酸桿菌株,它的抗原類型和沙門氏菌屬具有很高相似性。

檸檬桿菌屬除了能夠在沙門氏菌選擇培養基中生長外,還可在其他培養基中生長,如志賀氏選擇培養基,脫氧膽酸鹽培養基、亮綠瓊脂培養基,亞硫酸鉍培養基等。但是并非所有檸檬酸桿菌都能夠產生H2S,根據伯杰氏系統細菌學手冊介紹,11種檸檬酸桿菌之間生理生化特性存在較大的差異,如下表所示C. farmeriC. koseriC. rodentiumC. sedlakii無法產生H2S C. koseriC. rodentium菌種無法在KCN培養基中生長;C. braakiiC. farmeriC. koseriC. rodentium C. sedlakiiC. amalonaticus可以利用鳥氨酸;C. youngeC. braakiiC. farmeri C. murrlinae無法利用丙二酸鹽;但是研究發現檸檬酸桿菌屬11個種都可以利用檸檬酸鹽。

兩屬的理化特性比較

許多研究表明,沙門氏菌屬(Salmonella)和檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)之間生理生化反應有許多相似之處。因此,在第二版《伯杰氏系統細菌學手冊》的檸檬酸桿菌屬這篇中,出現了許多與沙門氏菌屬相似的理化特性介紹。如大部分菌種氧化酶測試、脂肪酶、苯丙氨酸脫氨酶都呈陰性,能利用檸檬酸酸鹽,而且可以利用硫代硫酸鹽產生H2S利用葡萄糖產酸產氣等重要理化特性。

當然,通過整理我們也發現了檸檬酸桿菌屬和沙門氏菌屬在理化特性上的主要差異在吲哚測試、KCN 生長、蔗糖利用、乳糖利用、尿素分解、賴氨酸脫羧酶上:檸檬酸桿菌屬大部分菌種,吲哚測試陽性,可在KCN 培養基上生長,另外可以利用蔗糖、乳糖以及分解尿素;而沙門氏菌大多數菌種則吲哚測試陰性,無法在KCN 培養基上生長,不能利用蔗糖、乳糖以及分解尿素,但是沙門氏菌屬中大部分菌種賴氨酸脫羧酶陽性,而檸檬酸桿菌屬是陰性。

2015版《中國藥典》中,控制菌檢查法——沙門氏菌檢查法中,采用木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基和三糖鐵瓊脂培養基的篩菌及顯色來檢測沙門氏菌。首先,利用木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基中脫氧膽酸鹽鈉抑制革蘭氏陽性菌的生長來篩菌;然后基于菌種能夠產生H2S的特性,以及H2S和培養基中的鐵鹽反應顯色來鑒定沙門氏菌。三糖鐵培養基中分離鑒定的原理是根據腸桿菌科對糖的利用和硫化氫的產生來鑒定的。三糖是指該培養基中的乳糖、蔗糖和葡萄糖,大致比例為10:10:1,鐵是指硫酸亞鐵。沙門氏菌在三糖鐵培養基中利用微量葡萄糖,產生少量酸性物質,使培養基先變黃,在接觸空氣后被氧化又變成紅色(另外,沙門氏菌還可利用培養基中含氮物質,生成堿性物質,也可使培養基變成紅色,如果菌株能夠大量利用乳糖和蔗糖產酸,則培養基菌落會顯黃色)。

此外,一個重要顏色反應是沙門氏菌可利用培養基中硫代硫酸鹽和氨基酸類產生H2S,產生的H2S和硫酸亞鐵反應生成黑色的硫化亞鐵,所以菌落大都呈現邊緣紅色中間黑色的形態,如下圖一。所以,如果有些菌株能夠利用葡萄糖產酸,以及能夠利用硫代硫酸鹽產生H2S,如部分檸檬酸桿菌,則會在選擇性培養基中呈現和沙門氏菌一致的狀態。我們對《伯杰氏系統細菌學手冊》檸檬酸桿菌和沙門氏菌的理化特性進行的整理比較發現,所示兩種菌屬都可以產生H2S(見表1和表2),因此沙門氏菌選擇性培養基中出現檸檬酸桿菌屬具備合理性。正由于可能出現假陽性結果,藥典沙門氏菌檢測法中也強調了如果三糖鐵培養基中出現疑似沙門氏菌時,仍需要進一步進行其他適宜的鑒定試驗。

 

兩屬分子水平比較

檸檬酸桿菌屬和沙門氏菌屬,除了理化性質上相似外,其整體基因組特性也有一定的相似性,Alyssa M. Walterson John Stavrinides 等人通過將腸桿菌科中各個屬內的整個物種群的全基因組的共享蛋白同源物進行構建進化樹分析(見圖二),檸檬酸桿菌屬和沙門氏菌屬最為接近,其次是埃希氏菌屬(Escherichia),這表明兩屬的基因組背景較為相似。但是,我們對檸檬酸桿菌屬11個種,以及沙門氏菌屬2個種的16S rDNA序列進行比較發現,其16Sr DNA序列具有許多位點差異(見圖三),兩個菌屬可以利用16Sr DNA分開。這說明16S rDNA序列可以用來鑒定區分沙門氏菌屬和檸檬酸桿菌屬。

沙門氏菌和部分檸檬桿菌屬通過代謝產生H2S具有相似的遺傳基礎。研究表明,沙門氏菌屬之所以可利用硫代硫酸鹽產生H2S,是由于硫代硫酸鹽還原酶(Thiosulfate Reductase GenePHS)參與其重要活動,編碼該還原酶的基因活性受到硝酸鹽的影響,如果在培養基中添加10mm硝酸鹽,可以阻止菌株產生H2S[14],[15]。為進一步了解PHS基因特點,我們從NCBI上下載了4個菌株的全基因組,分別是:弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii CFNIH1)、腸沙門氏菌(Salmonella enterica ATCC18)、科氏檸檬酸桿菌(Citrobacter Koseri ATCC BAA-895)和陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae ATCC 13047)。以往的理化研究表明,科氏檸檬酸桿菌和陰溝腸桿菌通常都不會利用硫代硫酸鹽產生H2S,而弗氏檸檬酸桿菌和腸沙門氏菌通常都會利用硫代硫酸鹽產生H2S。通過全基因組分析發現,弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundiiCFNIH1)和腸沙門氏菌(Salmonella enterica ATCC18)都擁有三個連續的PHS基因(2PHS基因較短,1PHS基因較長)(見圖四);而科氏檸檬酸桿菌(Citrobacter Koseri ATCC BAA-895)只有一個PHS基因,且片段較短;陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae ATCC 13047)則沒有PHS基因。這表明沙門氏菌和檸檬酸桿菌之所以可以利用硫代硫酸鹽產生H2S,可能是受到這三個連續的PHS基因調控。

此外,我們分離得到一株能夠在沙門氏菌選擇性培養基中生長,且理化現象疑似沙門氏菌的菌株(我們命名為YSSM),通過16S rDNA序列鑒定為——弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii),進一步對其進行基因組測序和生物信息學分析發現,其基因組中也含有3個連續的PHS基因,且和上述2種菌(Citrobacter freundii CFNIH1Salmonella enterica ATCC18)具有相似的PHS基因結構(2PHS基因較短,1PHS基因較長),這表明無論沙門氏菌還是檸檬酸桿菌,三個連續PHS基因可能是利用硫代硫酸鹽產生H2S的關鍵基因。

 

總結和討論

綜上所述,沙門氏菌屬和檸檬酸菌屬在生理、生化特性上有許多相似性,如氧化酶測試、脂肪酶、苯丙氨酸脫氨酶都呈陰性,大部分菌種都能利用檸檬酸酸鹽,而且都可以利用硫代硫酸鹽產生H2S(這也是造成沙門氏菌選擇性培養基出現假陽性的主要原因)。另外兩菌屬之間也存在許多不同之處,如在吲哚測試、KCN 生長、蔗糖利用、乳糖利用、尿素分解、賴氨酸脫羧酶上,其中檸檬酸桿菌屬大部分菌種,吲哚測試陽性,可在KCN 培養基上生長,另外可以利用蔗糖、乳糖以及分解尿素,而沙門氏菌大多數菌種則吲哚測試陰性,無法在KCN 培養基上生長,不能利用蔗糖、乳糖以及分解尿素,但是沙門氏菌屬中大部分菌種賴氨酸脫羧酶陽性,而檸檬酸桿菌屬是陰性。

因此,2015版藥典中也明確提到,當三糖鐵培養基中出現疑似沙門氏菌的菌落時,仍然需要進一步進行適宜的鑒定試驗,因為理化特性容易受到外界環境和菌株本身生長狀態等多種因素影響,所以不排除假陽性。

在整體基因組水平,沙門氏菌屬和檸檬酸菌屬也有一定的相似性,通過將腸桿菌科中各個屬內的整個物種群的全基因組的共享蛋白同源物進行構建進化樹分析發現,檸檬酸桿菌屬和沙門氏菌最為接近,其次是埃希氏菌屬。此外,我們通過比較16S rDNA序列比對發現,檸檬酸桿菌屬下面11個種和沙門氏菌屬下面2個種之間存在差異位點,可以利用16S rDNA序列來區分檸檬酸桿菌屬和沙門氏菌屬。

我們還對5株菌——弗氏檸檬酸桿菌、腸沙門氏菌、科氏檸檬酸桿菌、陰溝腸桿菌和本實驗的YSSM(實際為弗氏檸檬酸桿菌)的基因組分析發現,理論上能產生H2S的菌株,其基因組上都具有三個連續的PHS基因,這可能就是沙門氏菌屬和檸檬酸菌屬利用硫代硫酸鹽產生H2S的關鍵基因。

信息來源: 微生物所編輯部  微生物研究所 公眾號

 

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